Avant tout essai de coloration il faut examiner soigneusement votre objet et vous assurer qu’il est vivant. Si c’est par exemple un infusoire nageur, il est mobile et passe parfois très rapidement dans le champ de votre objectif. Si ce sont des objets immobiles, un examen attentif à fort grossissement permet de déceler au sein de la, ou des cellules les mouvements des inclusions intracytoplasmiques telles que chloroplastes naturellement colorés en vert, ou la pulsation de vacuoles excrétrices, ou des battements de flagelles, ou des courants intracytoplasmiques, ou des déplacements de la cellule entière si c’est une amibe.

Si l’objet est mobile il convient de l’immobiliser sans le tuer pour pouvoir l’observer vivant avant coloration. On peut procéder ainsi:
Préparer à l’avance des lames porte-objets très propres et dégraissées en plongeant des lames neuves, n’ayant jamais servi, pendant quelques minutes dans une solution d’ammoniaque diluée dans 75% d’eau environ. Rincer à l’eau distillée ou désionisée et laisser sécher à l’abri des poussières, pendant au moins une journée. Plonger ces lames dégraissées dans une solution d’eau gélosée à 1% environ. Les laisser sécher à l’abri de la poussière. On peut aussi étendre une goutte de cette eau gélosée sur une des faces de la lame seulement comme si on faisait un frottis. Dans ce cas la lamelle couvre objet carrée ou rectangulaire doit  être inclinée à 45° environ par rapport au plan de la lame et la goutte d’eau gélosée doit être sous cet angle et tirée et non poussée pour bien être étalée. On peut aussi étaler la goutte avec une aiguille à repriser en la roulant sur la goutte. Laisser sécher à l’abri de la poussière. Les lames ainsi préparées se conservent indéfiniment dans un endroit sec.

Si les micro-organismes à observer sont naturellement en suspension dans de l’eau, un prélève une goutte de cette eau avec une baguette d’agitateur en verre ou une micropipette et on la dépose au centre de la lame gélosée que l’on recouvre aussitôt d’une lamelle couvre-objet, sans aucune compression mécanique. La goutte d’eau s’étale entre la lame et la lamelle et provoque le gonflement de la gélose, ce qui  immobilise progressivement les cellules nageuses en les étalant sous la lamelle couvre-objet, les mettant ainsi en position idéale pour une bonne observation .
Si les cellule observées n’ont aucune inclusion naturellement colorée il est recommandé de procéder à une «coloration vitale», c’est à dire à une coloration qui ne tue pas la cellule. Très peu de colorants le permettent. Voici les principaux:
Rouge neutre, Bleu de méthylène, Bleu de Crésyle brillant, Bleu de Nil. Ils colorent les vacuoles ainsi que certaines inclusions graisseuses. Mes deux préférés sont le Rouge neutre très peu toxique, mais faible intensité des colorations et le Bleu de Crésyle, donnant des colorations intenses orthochromatiques bleues ou parfois métachromatiques  rouges.
Comme les solutions de ces colorants ne se conservent que peu de temps, il est préférable de déposer avec une aiguille un tout petit cristal de colorant sur la lame avant de déposer le goutte d’eau contenant les objets. Le colorant se dissout dans l’eau et diffuse lentement ce qui permet une coloration progressive de ce que l’on observe.
Comme l’eau a tendance à s’évaporer sur le pourtour de la lamelle, on peut empêcher cette évaporation en déposant aux quatre coins de celle-ci une microgoutte d’huile de paraffine, qui étant perméable à l’air, évite l’asphyxie des cellules.